EX-CELL®  Cellvento™ 4CHO流加培养基
生产培养基和补料
• 1.03795.0010   EX-CELL®Cellvento™ 4CHO COMP
• 1.03796.0005   EX-CELL®Cellvento™ 4Feed COMP

添加物
• 1.02415.0400 葡萄糖，用于细胞培养基
• 1.00286.1000 L- 谷氨酰胺，EMPROVE®exp
• 1.37013.2500 碳酸氢钠，EMPROVE®bio
• 1.37020.5000 氢氧化钠颗粒，EMPROVE®bio
• 根据需求，HT 补充物 (50x)

过滤
• GPWP02500 – 密理博 Express®PLUS 膜，0.22 µm， 25 mm
• GVWP02500 – Durapore® 膜，0.22µm， 25mm

* 所有部分均可单独供应。

化学成分限定细胞培养基，用于流加培养

现今，哺乳动物细胞表达体系是生产复杂的生物治疗用蛋白质的主要工具。为开发这样的生物制品，通常使用不同的 CHO 宿主细胞，与几种表达系统（例如 dhfr、UCOE或谷氨酰胺合成酶 (GS) 系统）组合。本工艺指南中所述的培养基平台，可用于广泛的 CHO 细胞的生长。在流加培养模式中，生产培养基支持最初的细胞生长和生产，而高度浓缩的中性 pH 流加培养基则用于补充消耗的细胞功能所需营养物质，以维持和延长生产期。该单一流加培养基被浓缩到 130 g/L 以上，可减少向培养基中添加的流加体积，从而提高体积生产率。这款流加培养基含有半胱氨酸和酪氨酸衍生物，已显示会在整个培养过程中缓慢释放游离半胱氨酸和游离酪氨酸。这种随时间推移的释放，避免了酪氨酸耗尽。该过程也导致释放游离半胱氨酸，同时保持氧化还原环境。这常常与更高的细胞生长和生产率有关。

流加培养基系统

EX-CELL®Cellvento™4CHO 培养基及其配套EX-CELL®Cellvento™4Feed 补料是化学成分限定、非动物来源的产品，设计用于基于 CHO 细胞的哺乳动物细胞培养。该培养基及其流加培养基能够有效支持CHO 悬浮培养细胞系实现高密度细胞生长和提高生产率。与所有流加培养工艺一样，建议优化流加体积和流加频率。

产品使用

• EX-CELL®Cellvento™ 4CHO 培养基及其配套流加培养基被设计用于重组 CHO 悬浮培养细胞，但也不排除它们能够用于其他细胞系。
• 培养基不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，以便也能够广泛用于 dhfr 转染细胞。流加培养基不含葡萄糖，以便能够在流加培养过程中对葡萄糖浓度进行微调，从而最大限度地减少乳酸产生。流加培养基含有半胱氨酸和酪氨酸来源物质，不应当补充任何额外的碱性流加培养基。
• EX-CELL®Cellvento™ 4CHO 培养基应当用作流加培养应用中的扩增培养基和生产培养基。

在流加培养模式中，使用 EX-CELL® Cellvento™ 4CHO 培养基

• 使用 EX-CELL®Cellvento™ 4CHO 培养基培养非 GS CHO 细胞系之前，添加 4-8 mM L- 谷氨酰胺。
• 在用于非 dhfr 系统之前，添加 1x HT
• 在流加培养中，EX-CELL®Cellvento™ 4Feed 不需要额外补充 L- 谷氨酰胺、L- 半胱氨酸或 L- 酪氨酸。
• 应当通过实验来确定最佳的 EX-CELL®Cellvento™ 4Feed 添加体积和时间（见指南）
• 在整个流加培养过程中，应当每天监测葡萄糖，在流加时单独添加葡萄糖，以保持适当的葡萄糖水平。
• 在种子培养扩增期间，如有需要，应当添加细胞筛选压力。通常，我们建议去掉在流加培养生产步骤和培养期间的选择压力。

EX-CELL® Cellvento™ 4CHO 培养基系统评价选项

直接驯化
细胞系可在 EX-CELL® Cellvento™ 4CHO 培养基中直接驯化。细胞接种密度应当为 3 x105– 5 x105 细胞 /mL，然后当密度达到 1 x106–3x106 细胞 /mL，且活率≥ 80% 时，对细胞执行传代培养。当细胞获得稳定的倍增时间（20-30 小时），且VCD ≥ 90%，至少 2-3 次传代，则驯化完成。

起初在任何第一代 Cellvento™ CHO 产品中驯化和培养的细胞，均可在 EX-CELL® Cellvento™ 4CHO 中直接解冻或培养。

逐步驯化
下面提供的驯化指南，依靠定期细胞次代培养，以保持培养物处于对数生长期。这通常意味着细胞每 3-4 天应当进行一次传
代。建议每个驯化步骤至少进行两次传代，以确保细胞较好地适应至新的培养基环境中。

低温保藏

将细胞冷冻于90% EX-CELL®Cellvento™ 4CHO培养基和细胞培养级别的10%二甲基亚砜(DMSO)中，创建活细胞库。

细胞冷冻操作程序

• 在洁净台或层流罩下，以 1:9 体积比，混合无菌 DMSO 与 EX-CELL®Cellvento™ 4CHO 培养基。配制时，由于 DMSO稀释过程会放热，应当预先配制冷冻培养基，储存在 2-8°C 环境中备用。
• 选择处于对数生长中期、具有正常形状的细胞，细胞密度应当 >1.5x106 细胞 /mL，活率 >95%。
• 以 1200-1500 rpm 离心 5 分钟 (200-300g)。
• 弃去上清液，让细胞再悬浮于低温的冷冻培养基中（细胞密度为 1x107- 2x107 活细胞 /mL），将细胞悬液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管 1mL。
• 冷冻程序（使用盛有异丙醇的冷冻容器）：将冻存管放进低温箱，遵循连续降温程序冷冻细胞：
- 在 4°C 下 30 分钟
- 在 -20°C 下 2-4 小时
- 在 -80°C 下过夜
- 将冻存管转移到液氮罐中，以长期储存。

注意：使用自动冷却仪器，可使冷冻程序标准化。在这种情况下，冷却速度受控，细胞悬液通常在 1 小时内从 4 °C 冷冻到–150 °C。

细胞解冻和复苏程序

• 准备 37°C 水浴，用来复苏细胞。
• 在洁净台或层流罩下，在 50 mL 离心管中添加 10 mL 培养基。
• 将液氮中的 CHO 细胞冻存管转移到 37°C 水浴中。
• 当冰颗粒与冻存管壁分离，取出冻存管（温度更高时，DMSO 可能有毒性作用）。
• 将 CHO 细胞悬液从冻存管转移到离心管中，以 1200-1500 rpm 离心 5 分钟。
• 弃去上清液，让细胞再悬浮于新鲜培养基（EX-CELL®CellventoTM 4CHO 培养基）中，以获得接种密度 3x105– 5x105 细胞 /mL，然后转移到 125mL 摇瓶中培养。在 37°C CO2 培养器（5%CO2，80% 湿度，转速 100 rpm）中培养细胞，直至密度达到≥1x106 细胞 /mL。然后，遵循标准规程，进行传代培养。